A propos d’un effet paradoxal de la cycloheximide sur l’œuf Anemia salina

La cycloheximide inhibe la synthèse des protéines au niveau des ribosomes. Elle empêcherait la liaison initiale de m-RNA aux ribosomes en une structure du type polysome, et le glissement du messager contre les ribosomes (Colombo, Felicetti & Baglioni, 1965). Sur l’œuf d’Artemia salina, en segmentation, elle se révèle être un antimitotique puissant, agissant jusqu’à de très fortes dilutions ⁠. NOUS reviendrons ailleurs sur les particularités de cette action, mais voudrions tirer l’attention, ici, sur une activité apparemment paradoxale observée fortuitement. Il s’est révélé en effet que des concentrations plus faibles encore peuvent induire la division cellulaire de jeunes œufs indivis, fraîchement fécondés, dans des lots, où les témoins ne se divisent pas in vitro.

Les œufs d’Artemia salina sont prélevés dans l’ovisac et recueillis dans des salières contenant soit un liquide salin (témoins) (Fautrez-Firlefyn & Van Dyck, 1961), soit ce même liquide auquel de la cycloheximide fut ajoutée (œufs expérimentés).

Dans le présent travail nous ne nous intéressons qu’à certains lots d’œufs indivis, prélevés rapidement après leur descente dans l’uterus et leur fécondation (Fig. 1), toujours avant le soulèvement de la membrane vitelline. Ces œufs se reconnaissent aisément, sous la loupe binoculaire, des œufs ayant soulevé leur membrane. Les premiers sont en effet légèrement aplatis et mats; les seconds sont sphériques et brillants.

Alors que dans nos conditions de culture, les œufs indivis ou aux premiers stades de la segmentation se développent jusqu’au début de la gastrulation, il arrive cependant que des lots d’œufs indivis ‘mats’ ne se divisent pas. Ayant fortuitement constaté que dans ces cas, la cycloheximide à de faibles concentrations pouvait permettre à la segmentation de se réaliser, nous avons repris 10 fois cette expérience, en utilisant différentes concentrations allant de M à 1 × 10^{− 6} M.

Les germes sont examinés vivants, et après 6 à 7 heures il sont fixés pour examen microscopique. Le fixateur utilisé est l’alcool-formol-acétique. La coloration des œufs coupés en série se fait au bleu de toluidine ou à la réaction de Feulgen.

La plupart des œufs soulèvent leur membrane de fécondation, environ quatre heures après leur descente dans l’utérus. Ils ne présentent aucun signe, visible à la loupe, de division cellulaire. Quelques rares germes cependant restent mats et collent plus ou moins fortement au fond du récipient. Ces derniers présentent plusieurs ondes de division. Dans ces œufs aplatis, les blastomères sont anormalement disposés, pratiquement tous dans un seul plan.

A l’examen microscopique des témoins, qui sont restés indivis et qui ont soulevé leur membrane vitelline, on observe des figures pluricentriques, qui occupent le centre de l’œuf. Les centres sont des sphères peu colorées, reliées par des images fibrillaires, constituant des fuseaux anarchiques dans lesquels des chromosomes se retrouvent deci-delà en plaques équatoriales ou en amas plus irréguliers (Fig. 2, 3). Plus rarement on trouve un seul noyau en inter-cinèse, près d’un des pôles de la figure pluricentrique (Fig. 4). Dans 6 séries de témoins, nous ne trouvons pratiquement que des œufs présentant cet aspect particulier. Dans les 4 autres séries, de rares germes ont atteint le stade des deux pronucléi, apparemment normal, auquel ils sont figés.

Sporadiquement on observe des œufs, qui ne soulèvent pas leur membrane vitelline; ils restent flasques et se divisent. A l’examen microscopique, on trouve des blastomères étalés en un plan. Tl est remarquable que, même dans ces conditions, les cycles cellulaires restent absolument synchrones. La Fig. 5 montre un de ces œufs, où tous les noyaux sont en prophase; dans l’œuf représenté sur la Fig. 6, ils sont tous en métaphase.

1. La solution M n’a aucune action décelable sur les germes, qui ont le même aspect que les témoins.

2. La solution M est à la limite de l’activité. Sur 7 lots d’œufs, un seul présente des germes, qui sont tous semblables aux témoins. Dans les autres lots on obtient un mélange. De très nombreux œufs sont arrivés, au moment de la fixation, aux stades à II (Fig. 7) ou IV blastomères. Dans un lot de nombreux germes avaient atteint le stade VIII (Fig. 8). Très souvent, au stade à II blastomères, la cloison séparant les deux cellules ne se développe que d’un seul côté (Fig. 9,10). Dans la plupart des lots, on rencontre en outre des germes bloqués au stade des 2 pronucléi (Fig. 11), ou à diverses phases de la première division de segmentation. Mais à l’exception des germes à cloisonnement incomplet, tous ces éléments ne sont pas différentiables, morphologiquement de germes normaux, fixés à des moments correspondants du développement. Dans la moitié des échantillons environ, on rencontre une faible quantité d’œufs semblables aux témoins. Exceptionnellement, on peut trouver un germe indivis à plusieurs noyaux intercinétiques dans un complex pluricentrique (Fig. 12).

3. La solution 1 × 10⁻⁷ M a une action plus prononcée que la précédente. Jamais plus nous y avons rencontré des germes semblables aux témoins. Sur 7 lots examinés, 1 seul était composé essentiellement de germes au stade à IV blastomères. Dans 5 autres nous avons trouvé le plus grand nombre d’œufs à II blastomères. Dans 1 seul, les éléments étaient figés au stade des 2 pronucléi. Dans quatre des cinq lots où les œufs au stade II prédominaient, on découvrit quelques germes présentant encore les 2 pronucléi, et d’autres arrêtés au cours de la première mitose de segmentation.

4. La solution à M ne fut utilisée que pour deux lots. Dans un des lots, certains œufs avaient atteint le stade à II blastomères; d’autres restaient figés à celui des 2 pronucléi. Dans l’autre lot, on observe divers stades, d’aspect normal, de la première division de segmentation.

5. La solution à 1 × 10⁻⁶ M bloque tous les œufs au stade des 2 pronucléi situés au centre du germe, soit encore à sa périphérie. Il s’agit du blocage de la segmentation au même moment où la cycloheximide arrête, aussi à des concentrations plus élevées des œufs immergés au stade indivis jeune, aussi dans des expériences dans lesquelles les témoins se divisent anormalement.

L’effet de la cycloheximide permettant du moins l’initiation d’une segmentation apparemment normale d’œufs indivis, venant de descendre dans l’ovisac, alors que les témoins restent indivis, se manifeste dans des limites de concentration très étroites. D’une part la concentration M n’a aucune action visible. D’autre part la concentration 1 × 10⁻⁶ M bloque les œufs au stade des deux pronucléi, c’est-à-dire au stade où des œufs mats, dont les témoins sont capables de se segmenter, sont arrêtés par l’action antimitotique du produit, utilisé à cette même concentration ou à des concentrations plus élevées. Entre ces deux extrêmes on voit que la concentration à M présente l’effet favorisant, mais que toutefois un certain nombre d’œufs reste encore semblable aux témoins. Par contre, les solutions à 1 × 10⁻⁷ M et à M permettent la division cellulaire, mais on constate déjà, pour un certain nombre de germes, le blocage au stade des pronucléi.

Il n’est pas simple de s’imaginer le mécanisme de cette influence, qui régularise et favorise la division cellulaire. Si l’on se souvient que la cycloheximide est connue comme un inhibiteur de la synthèse des protéines, l’hypothèse la plus vraisemblable nous semble être l’inhibition par l’antibiotique d’une protéine inhibitrice de la division cellulaire. La synthèse de cette protéine inhibitrice serait particulièrement sensible à la cycloheximide, et le serait encore à des doses où la synthèse des protéines nécessaires à la division n’est plus influencée.

Insistons sur le fait qu’il ne peut s’agir ici, que d’une simple hypothèse, basée sur des déductions indirectes. La synthèse de protéines, pas plus que l’inhibition de celle de certaines parmi elles sous l’effet de la cycloheximide, n’a pu être mise en évidence jusqu’ici sur notre matériel par des tests et des mesures directs, faute de technique appropriée. Ce n’est que par analogie avec ce que l’on sait sur l’action du produit utilisé sur d’autres matériaux (Wettstein, Noll & Penman, 1964; Colombo et al. 1965), que nous estimons pareille assertion plausible, tout en nous rendant compte que l’interprétation de l’effet d’un inhibiteur reste toujours délicate et qu’il pourrait sans doute agir sur le métabolisme cellulaire par des mécanismes différents.

La cycloheximide, à des doses plus fortes que celle que nous avons utilisées ici, se révèle sur l’œuf &Artemia en segmentation comme un antimitotique puissant (résultats inédits). Son effet antimitotique est en grandes lignes semblable à celui de la puromycine (résultats inédits), agent qui s’est également révélé être un inhibiteur de la synthèse protéique au niveau de la traduction (Colombo et al. 1965), et à celui de l’actinomycine D (Fautrez-Firlefyn & Fautrez, 1966) et de la proflavine (Fautrez & Fautrez-Firlefyn, sous presse) dont l’action sur la transcription est généralement admise (Hurwitz, Furth, Malamy & Alexander, 1962). Il nous semble donc assez logique d’admettre que les 4 agents, réputés comme des inhibiteurs de la synthèse des protéines, produisant un effet antimitotique semblable sur notre matériel, le feraient par le mécanisme qui leur est commun.

Il nous semble en outre indispensable de rapprocher ces observations des résultats antérieurs (Fautrez & Fautrez-Firlefyn, 1961), où nous avons montré que des œufs vierges étaient activés, et pouvaient présenter des divisions abortives, à condition de quitter l’oviducte. Cette réaction pouvait être obtenue de deux manières différentes. Les œufs peuvent être extraits de l’oviducte et recueillis dans un milieu physiologique. On pouvait encore les laisser descendre dans l’ovisac chez des femelles séparées de mâles: ils n’y étaient donc pas fécondés comme normalement. Dans ces conditions, nous avons cru pouvoir conclure à la présence, dans l’oviducte, d’un facteur empêchant des divisions cellulaires d’œufs immatures.

Nos présentes expériences permettent, nous semble-t-il, de faire un pas de plus. Le facteur frénateur de l’oviducte agit par l’intermédiaire de métabolites synthétisés par le germe lui-même, puisque la cycloheximide agissant sur les œufs recueillis in vitro, lève l’inhibition en frénant cette synthèse.

Mais il y a plus: les œufs dont-il s’agit dans ces nouvelles expériences sont fécondés. En effet, la fécondation a lieu dès la descente dans l’ovisac de la femelle, non séparée des mâles, qui est un véritable réceptacle de spermatozoïdes. De plus quelques rares œufs-témoins, et d’assez nombreux germes traités à la cycloheximide sont arrêtés au stade des deux pronucléi. D’autres œufs soumis à la cycloheximide parcourent les premiers stades d’une segmentation normale. Tous ces phénomènes sont le fait d’œufs fécondés.

Si les œufs descendus dans l’ovisac avaient été laissés en place, ils auraient connu un développement normal. Dans des centaines de ces femelles, observées au cours de 25 ans de recherches, nous n’avons jamais trouvé un arrêt du développement semblable à celui de nos germes-témoins.

L’interprétation la plus plausible de nos résultats nous semble donc être qu’après un court séjour dans l’ovisac, l’œuf, qui vient d’être fécondé est capable d’entrer en segmentation, parce qu’un facteur, contenu dans le suc de l’ovisac, inhibe la synthèse d’inhibiteurs de la division. Il faut un certain temps d’action de ce facteur de l’ovisac pour permettre la segmentation normale. Si l’œuf lui est soustrait trop tôt, on obtient le résultat qu’illustrent nos témoins. Mais l’action de la cycloheximide, à très faible dose, peut mimer l’effet désinhibiteur du facteur présent dans le suc de l’ovisac.

Cette hypothèse peut rendre compte de tous les effets observés. Les œufs extraits de l’ovisac après un séjour suffisant vont se développer in vitro, jusqu’au début de la gastrulation. Extraits rapidement après la fécondation, encore en métaphase de la I^e division de maturation, ils sont encore sous l’effet des protéines inhibitrices de la division. Celles-ci permettent dans les œufs extraits déjà la division des centres, mais pas encore celle des noyaux, ni surtout la cytodiérèse, et l’on obtient l’image habituelle, observée dans nos témoins. Si pour une raison, qui nous échappe encore, la membrane vitelline n’est pas soulevée, on peut supposer, que par une plus grande perméabilité la protéine inhibitrice se perd dans le milieu; les mitoses de segmentation sont normales et même remarquablement synchrones, comme dans la segmentation normale. Seuls les rapports entre les blastomères sont anormaux dans les germes flasques et aplatis. Après soulèvement de la membrane vitelline les protéines inhibitrices quittent moins le germe ou restent concentrées dans le liquide périvitellin.

La cycloheximide, inhibitrice des synthèses protéiques, pourrait, à très faible dose mimer l’action d’un facteur contenu dans le liquide de l’ovisac, après extraction précoce. Elle va rendre possible la division nucléaire et enfin la cytodiérèse, qui souvent reste encore troublée et partielle. Elle inhibe les facteurs protéiques, qui empêchent la division d’œufs encore immatures. Dans les meilleurs cas on arrive, dans les délais de l’expérience à des stades VIII, apparemment normaux. Si la dose frôle l’effet antimitotique de l’antibiotique, on arrive à un arrêt au stade des deux pronucléi, qui est typique pour l’action de la cycloheximide à des concentrations plus élevées, dans des expériences où des témoins sont déjà capables de se segmenter.

Ces expériences semblent donc montrer l’existence d’un équilibre délicat entre des facteurs, peut-être de nature protéique, qui rendent possible la segmentation normale d’un œuf fécondé, et ceux qui inhibent des divisions inadéquates d’un germe encore immature. L’intervention d’un facteur sécrété par l’oviducte serait responsable de l’arrêt à la métaphase de la première division de maturation. Il agirait par l’intermédiaire de protéines synthétisées par le germe lui-même. Cette synthèse serait moins importante dans les germes élevés in vitro, et rapidement inhibée par un facteur présent dans le suc de l’ovisac.

A de très faibles concentrations, la cycloheximide permet l’entrée en segmentation d’œufs d”Artemia, qui viennent d’être fécondés, alors que les témoins restent indivis.

L’hypothèse est émise qu’à des doses minimes, la cycloheximide pourrait inhiber dans les œufs la synthèse de protéines, activée par un facteur présent dans l’oviducte, et tendant à empêcher des divisions d’œufs immatures. Elle pourrait mîmer l’action d’un facteur contenu dans le suc de l’ovisac et rendant possible la segmentation normale d’un œuf fécondé.